Le génie génétique: Principes et techniques

Introduction

Le génie génétique est un ensemble de techniques permettant d'identifier, d'isoler, de modifier et de transférer de façon contrôlée du matériel génétique. Il s'agit d'un outil aux applications extrêmement variées qui permet d'intervenir avec précision sur le patrimoine génétique des êtres vivants.

Dans la nature, il est possible qu'un gène soit transféré d'un être vivant pour s'incorporer dans le programme génétique d'un autre organisme.

I. Transfert Naturel des Gènes de l'Agrobacterium à une Plante

1. Données sur la Galle du Collet

En réaction à cette infection, les cellules du végétal se multiplient de manière importante et forment une tumeur qui libère dans le milieu des opines. Les bactéries présentes dans le sol près de la tumeur sont alors capables d'utiliser ces opines comme source d'azote, de carbone et d'énergie.

La réaction du végétal est due au transfert d'un petit ADN, l'ADN-T (ADN de transfert), depuis la bactérie jusque dans le génome des cellules de la plante par l'intermédiaire d'un plasmide (ADN circulaire bactérien de petite taille) appelé plasmide Ti (Tumor inducing).

Carte Génétique du Plasmide Ti

Fonction	Description
VIR	Fonction de virulence, responsable du transfert de l'ADN-T à la cellule végétale
ONC	Fonction oncogène, responsable de la multiplication cellulaire
OPS	Fonction opine synthase, responsable de la synthèse des opines
OCC	Fonction catabolisme des opines, permet aux bactéries de dégrader les opines
ORI	Origine de réplication du plasmide

Ainsi, la bactérie Agrobacterium oriente l'activité de la cellule végétale à son profit. Elle réalise donc, naturellement, une transformation génétique d'un organisme végétal. Une fois ce mécanisme connu, l'ADN-T a été rapidement proposé pour être détourné dans un but de transgénèse (implanter un ou plusieurs gènes dans un organisme vivant). Pour cela, il «suffit» de remplacer l'ADN-T par un autre ADN portant un gène d'intérêt.

II. Les Techniques du Génie Génétique

1. Matériel Biologique Employé dans le Génie Génétique

a) La Bactérie Escherichia coli

Le matériel biologique le plus utilisé dans le génie génétique est la bactérie Escherichia coli, et ce pour plusieurs raisons essentielles:

• Elle possède, en plus de son unique chromosome, des plasmides
• Elle se reproduit très vite, permettant d'obtenir rapidement plusieurs générations successives
• Le cytoplasme de cette bactérie est riche en ribosomes et possède tous les éléments nécessaires à la synthèse des protéines

b) Les Enzymes de Restriction

Généralement, une enzyme de restriction coupe les deux brins au niveau de deux points décalés, ce qui donne des extrémités monocaténaires appelées bouts cohésifs.

Exemples d'Enzymes de Restriction

Enzyme	Source	Séquence Reconnue	Coupure	Après Coupure
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5'	5'-G↓GATCC-3'	G + GATCC
HaeIII	Haemophilus aegyptius	5'-GGCC-3' 3'-CCGG-5'	5'-GG↓CC-3'	GG + CC
PstI	Providencia stuartii	5'-CTGCAG-3' 3'-GACGTC-5'	5'-CTGCA↓G-3'	CTGCA + G
EcoRI	Escherichia coli	5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'	5'-G↓AATTC-3'	G + AATTC

c) Les Ligases

d) La Transcriptase Inverse (Rétro-transcriptase)

2. Les Étapes du Génie Génétique

Quel que soit l'objectif visé de la manipulation génétique, le transfert du gène d'une cellule à l'autre nécessite quatre étapes essentielles:

1. La recombinaison de l'ADN in vitro
2. Le clonage du gène
3. Le criblage des clones transformants
4. L'expression du gène

a) Recombinaison de l'ADN in vitro

La recombinaison consiste à isoler le gène désiré du chromosome d'une cellule et à l'insérer sur le plasmide bactérien. On obtient alors un plasmide recombinant.

Étape 1: Isolement du gène désiré

Le gène d'intérêt que l'on veut introduire dans une cellule peut provenir de tout organisme vivant (plante, animal ou bactérie), puisque le code génétique est universel. Ce gène doit être isolé de l'organisme donneur selon deux méthodes:

• Méthode 1: On extrait le gène par l'intermédiaire des enzymes de restriction qui permettent d'obtenir des fragments d'ADN avec des bouts cohésifs
• Méthode 2: On utilise l'ARNm compatible au polypeptide qu'on veut produire. Cet ARNm est transcrit en ADN complémentaire (ADNc) par l'intermédiaire de l'enzyme transcriptase inverse

Étape 2: Greffage du plasmide par le gène désiré

Le transfert des gènes vers d'autres organismes nécessite un vecteur capable de se transférer dans une cellule cible. Le vecteur utilisé dans ce cas est un plasmide.

• On procède à l'ouverture du plasmide avec des enzymes de restriction (souvent les mêmes utilisées pour la restriction du gène d'intérêt)
• On mélange les plasmides ouverts et les fragments de restriction dans le même tube à essai en présence d'une ligase
• L'appariement des bouts cohésifs se fait spontanément
• On obtient ainsi des plasmides recombinants (ou hybrides)

b) Clonage du Gène Désiré

Le clonage nécessite l'introduction du plasmide recombinant dans un système hôte, puis la mise en culture de cette bactérie dans un milieu favorable.

• Généralement, on utilise comme hôte les bactéries E. coli sans plasmide
• On rassemble les plasmides recombinants et des bactéries dans un milieu convenable
• On incite les bactéries à se multiplier, formant ainsi des colonies sous forme de clones
• Cela permet à certaines bactéries d'intégrer les plasmides recombinés

c) Criblage des Clones Transformants (Isolement des Transformants)

L'identification du clone transformant exige l'utilisation de marqueurs de sélection. Les marqueurs de sélection sont associés au vecteur ou au fragment d'ADN à détecter.

Criblage par l'Utilisation des Antibiotiques

Après le clonage du gène d'intérêt, ce ne sont pas toutes les bactéries qui intégreront les plasmides. Les cellules doivent donc être sélectionnées afin d'identifier celles qui auront intégré les plasmides.

Le plasmide utilisé possède deux gènes de résistance:

• Gène A: Résistance à l'antibiotique A
• Gène B: Résistance à l'antibiotique B

Le gène désiré s'intègre au sein du gène responsable de la résistance à l'antibiotique A. Après son intégration, le plasmide perd le gène A sans perdre le gène B. Donc, les bactéries portant le plasmide modifié seront:

• Sensibles à l'antibiotique A
• Résistantes à l'antibiotique B

Criblage par l'Utilisation des Sondes Radioactives

Étapes de la technique:

1. Transfert des bactéries sur une membrane de nylon ou de nitrocellulose
2. Chauffage puis trempage de la membrane dans une solution contenant des sondes radioactives
3. En diminuant la température, les sondes se fixent sur la partie de l'ADN ayant une séquence complémentaire (hybridation)
4. Rinçage pour retirer les sondes qui ne se sont pas hybridées
5. Autoradiographie: dépôt de la membrane sur un film radiographique pendant quelques jours
6. Les atomes radioactifs réagissent avec le film, permettant d'identifier les colonies contenant le gène recherché

L'Électrophorèse pour Isoler le Gène Désiré

• Les molécules anioniques (chargées négativement) migrent vers l'anode
• Les molécules cationiques (chargées positivement) migrent vers la cathode
• L'ADN est une molécule chargée négativement qui se déplace donc vers l'anode
• Les plus petites molécules migrent plus loin
• Les plus grosses molécules restent plus près des puits

Étapes d'isolement du gène:

1. L'électrophorèse sépare les fragments de restriction selon leur taille
2. Séparation des deux brins d'ADN par la soude
3. Addition des sondes radioactives
4. Repérage des fragments d'ADN hybrides par autoradiographie

d) Expression du Gène Désiré

Pour que le gène intégré dans le plasmide s'exprime dans la cellule hôte, celui-ci doit être entouré d'un système de contrôle. Ce système est constitué de séquences de gènes régulateurs et de gènes de structure que la cellule hôte devra reconnaître.

Le système de contrôle permet de connaître les signaux d'initiation de la transcription de l'ADN du gène, suivie de l'élongation et de la terminaison de l'ARNm.

III. Quelques Domaines d'Application du Génie Génétique

1. Production Industrielle de l'Insuline

Sa production insuffisante entraîne le diabète.

• Avant 1978: L'insuline était extraite des cellules de porcs et de vaches
• Problème: L'insuline d'origine animale provoque des effets secondaires tels que l'allergie
• Aujourd'hui: Les diabétiques disposent d'insuline humaine produite par génie génétique

Étapes de la production d'insuline:

1. Isolement du gène de l'insuline:
   • L'ARNm codant pour la synthèse des deux chaînes peptidiques A et B est isolé des cellules du pancréas
   • Par utilisation de la transcriptase inverse, on obtient de l'ADNc
   • Avec la polymérase, on obtient de l'ADNc bicaténaire (le gène codant pour l'insuline)
2. Préparation d'un vecteur de clonage:
   • Le plasmide pBR322 portant les gènes de résistance à l'ampicilline et à la tétracycline est choisi
   • Le gène de résistance à la tétracycline contient un site reconnu par l'enzyme BamHI
   • On intègre les gènes de l'insuline au sein de ce plasmide
3. Préparation de la cellule hôte:
   • Le plasmide recombinant est introduit dans une bactérie sans plasmide
   • La souche choisie est E. coli K12, initialement sensible à la tétracycline et à l'ampicilline
4. Sélection des clones porteurs des gènes d'insuline:
   • Le plasmide recombinant perd la résistance à la tétracycline
   • Les colonies capables de se développer sur un milieu contenant de l'ampicilline sont des bactéries ayant intégré le plasmide
   • Par repiquage sur un milieu contenant de la tétracycline, on repère les colonies résistantes à l'ampicilline et sensibles à la tétracycline
5. Vérification de la production de l'insuline:
   • On applique une membrane sur laquelle ont été fixés des anticorps capables de reconnaître l'insuline
   • À l'aide d'un second anticorps marqué, on détecte les clones bactériens capables de produire l'insuline
6. Expression des gènes d'insuline:
   • Les clones sélectionnés sont mis en culture à grande échelle
   • Le produit obtenu est purifié
   • L'insuline est analysée et testée sur les animaux

2. Lutte Contre les Insectes Nuisibles en Agriculture

La pyrale du maïs est un papillon nocturne. La femelle pond ses œufs à l'aisselle des feuilles du maïs. Après éclosion, les chenilles pénètrent dans la plante et provoquent des dégâts importants:

• Sensibilité à la casse des cannes
• Affaiblissement physiologique des plantes (canaux de sève endommagés)
• Risque de chute d'épis avant récolte

Les chercheurs ont découvert une protéine toxique, capable de détruire les chenilles de la pyrale, mais inoffensive pour les vertébrés. Le gène qui code pour cette protéine se trouve naturellement dans le programme génétique de la bactérie Bacillus thuringiensis.

Grâce aux techniques du génie génétique, on a pu produire des plantes génétiquement modifiées résistantes aux chenilles. Ces plantes sont capables de sécréter la protéine toxique pour les chenilles.

Étapes de la transgénèse pour obtenir un maïs résistant:

1. Extraction du gène d'intérêt: Extraction du gène qui code pour la protéine toxique à partir des cellules de Bacillus thuringiensis
2. Fixation du gène sur le plasmide:
   • Extraction d'un vecteur biologique (généralement le plasmide Ti de Agrobacterium tumefaciens)
   • Incorporation du gène de la protéine toxique au sein du plasmide
3. Introduction du plasmide recombinant dans une bactérie hôte
4. Transfert dans les cellules végétales par deux méthodes:
   • Méthode mécanique (Biolistique/Canon à ADN):
     • Projection de petites billes d'or ou de tungstène enrobées d'ADN
     • Ces billes ont suffisamment d'énergie cinétique pour traverser la paroi et la membrane des cellules sans leur infliger de dommages irréparables
   • Méthode chimique (Vecteur biologique):
     • Les bactéries Agrobacterium tumefaciens portant le plasmide modifié sont introduites dans un milieu contenant des protoplastes du végétal
     • L'Agrobacterium parasite spontanément les protoplastes et insère les gènes de la protéine toxique
5. Sélection des cellules modifiées génétiquement
6. Régénération de plantules modifiées
7. Multiplication des plantes par croisement
8. Obtention d'un maïs entier produisant son insecticide

Résumé des Concepts Clés

Concept	Définition
Génie génétique	Ensemble de techniques permettant de modifier le matériel génétique
Plasmide	ADN circulaire bactérien utilisé comme vecteur
Enzyme de restriction	Enzyme coupant l'ADN à des séquences spécifiques
Ligase	Enzyme collant des fragments d'ADN
ADN recombinant	ADN formé par l'association de fragments d'origines différentes
Transgénèse	Introduction d'un gène étranger dans un organisme
OGM	Organisme Génétiquement Modifié